====================================================================== ------------------- SQAMT News No.0009 [2003.06.01] ------------------ ====================================================================== [This is a bilingual mail, so please neglect queer characters if your software does not display Japanese characters. The English part appears after the Japanese part.] 　 ---------------------[Japanese part begins here]--------------------- 　「SQAMT News」は遺伝子検査精度保証研究会の発行する会員向けの電子メー ル新聞です。バックナンバーは下記ホームページの「本研究会について―出版 物」欄でご覧頂けます。 （末尾に「.pdf」がついている文書の表示には、http://www.adobe.co.jp/ で 無料配布されている Acrobat Reader の最新バージョンが必要です） 　遺伝子検査精度保証研究会および記事に関するお問い合わせ先 　　ホームページ： http://sqamt.umin.jp/ 　　電子メール　： sqamt-adm@umin.ac.jp 　なお、今後配布を希望されない場合には、誠に恐れ入りますが、その旨を書 き添えてこのまま返送して下さるようお願いいたします。 _____________________________________________________________________ Contents ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 論　壇　：遺伝子検査の標準化における必要決定事項（その１） 　 ----------------------------[SQAMT News]----------------------------- 論　壇　：遺伝子検査の標準化における必要決定事項（その１） 　　　　　‐specimenの取り扱いについて- ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ はじめに 　本電子メールニュースでは、遺伝子検査の標準化ガイドライン作製にあたり 決定していく必要があると考えられる項目について、米国での現状も参考にし ながら、概論したい。特に今回は、specimenの取り扱いについて簡単にまとめ てみた。（決して米国の方法がベストとは考えられないが、日本で新しいもの を作るうえで、有用と思われる箇所は取り入れていくことが、今後国際的に参 考とされ、信用される上で重要と考えたい）。ご承知のとおり標準化に際し必 要となる決定項目は相当数あるが、どのように、各施設間ので全行程の管理を ある程度統一（標準化）するかになると思われる。おおきくは、元サンプルお よび抽出核酸（の管理方法）、核酸抽出方法、試薬の管理、プライマーの設 計、標的遺伝子の検出プロトコールの整理、各方法における陽性コントロール および内部コントロールの決定、結果の報告および解釈、である。さらに、こ れら全ての行程をある程度統一化するために、推奨案、各種基準並びに注意点 を網羅したマニュアル作製と、実際に検査を行う者および責任者（プロフェッ ショナル）の指導育成が必要となる。これらはすべてquality controlの一言 に集約される。 　参考とした施設および団体には、Massachusetts General Hospital（MGH） を含めたHarvard医科大学関連病院、NCCLSを含む（上記病院およびNCCLSにつ いての情報は、現場視察あるいはCommitteeの関係者から得たものであること をお断りしておく）。NCCLSの情報については、未だ文章化はされていないも のの、2003-2004年度における遺伝子検査標準化に向けた取り組み案の会議資 料を参考にした。余談であるが、ちなみにNCCLSのMolecular Diagnostic Methodsのcommitteeは、総勢17名中、MD, PhDが2名（民間病院および大学病 院）、MDは１名、残りは全てPhD（民間検査会社から5名、大学から5名、NIHか ら1名、そしてNCCLSの母体から3名）となっている。 　米国では、一部の大学病院検査部を除き、ほとんどの場合、コストなどの問 題から遺伝子検査は企業（日本の大学病院でいう委託検査会社）が行ってい る。この話は、Harvard関連病院検査部など相当数の検査数をこなす施設で も、例外でなく、ほとんどの場合遺伝子検査部門というものはない。それぞれ の臨床部門が独自に行っているか、委託である。 　一方、前述した一部の大学病院検査部では、まずは大学としての研究レベル を民間のそれに劣ることなく進めることが前提となっている。さすがに、ゲノ ム解析など、大量の遺伝子情報を大量の自動分析器で返していくものについて は、圧倒的にベンチャー企業に道を譲ることになるが、それでもやはり、シス テム上大学でなければできない研究や遺伝子検査のやり方（機動性）があるこ とから、米国では一定数の大学検査部がその責務を果たし、その存続が認めら れている。 　米国と日本の現状比較であるが、まず、遺伝子検査標準化にむけた取り組み については、結論から言って米国との格差は思われているよりも少ない。現 在、NCCLSでも標準化に向けた取り組みは難しく暗中模索状態であるし、本年 度のトピックスも７項目中、比較的新しい検査項目を除き、標準化を銘打った 小committeeのテーマは、sample collection、quality assessment、および遺 伝子検査の臨床上の有用性の評価、の3つである。 　ちなみに、NCCLSで今年度具体的に取り上げられている新しい検査項目は、 癌、遺伝病および感染症診断におけるNucleic acid sequencing、感染症診断 におけるgenotyping（薬剤耐性の検出とモニタリング、疫学調査への応用）、 およびマイクロアレイ、に関する標準化である。特にマイクロアレイに関して は、日本でも常に話題となる話であり、我々が取り組む各方面での遺伝子検査 標準化の話題を凝縮した話でもあるが、内部コントロールの不安定性（各施設 で使用するものを何にするか）をはじめ、同じサンプルを測定した場合の各施 設間での結果の大きな違い（陽性コントロールの選択、機械間、実施者間、プ レート間の違い）をどう是正していくかについてが、大きな問題となってい る。 　今回の電子メールニュースでは、簡単ではあるが、まず管理行程の最初に問 題となるspecimenの取り扱いについてのモデルケースを、NCCLSの来年度へ向 けたガイドライン案も参考にしながら、自身の意見を概論したい。 １　Specimen (sample)の取り扱いについて 　遺伝子検査の対象となり得るサンプルは、全血、分離血液細胞、全尿、尿中 細胞、便、粘膜細胞、内視鏡などによる各臓器からのブラッシング、採取液、 biopsy specimen、羊水、喀痰、肺胞洗浄液・・・および得られた核酸（DNA およびRNA）、と多様である。まず、サンプルの取り扱い上、本人あるいは家 族のインフォームドコンセントの取得が必要な場合が少なくない（基本的には 全てのケースで必要となるが）。また、遺伝子検査の場合、他の検査と異な り、同一のサンプルを用いて、将来的に別の遺伝子検査あるいは同一遺伝子検 査を反復する可能性を持つ。さらに、近い将来、医師、検査技師、遺伝子診断 カウンセラー、看護婦などが共通に使用できるデータベースの構築上、以下の 項目を満たすファイルを標準化しておく必要がある。 1. 患者名 2. 生年月日 3. 採取年月日 4. 性別 5. 人種 6. サンプル保存番号：取り違えミスを起こさぬよう、保存容器にも同一番 　号、患者名、生年月日、採取年月日の記載が望ましい。個人別の保存容器の 　作成。 7. サンプルの種類 8. 検査理由 9. 臨床情報（診断名、症状、治療の有無および種類、他の検査情報） 10. 家系図 11. コスト 12. インフォームドコンセント取得の確認 13. 検査方法、使用キットおよび試薬種類、コントロールの種類 14. 検査結果 15. 医師名、検査技師名とそのサイン、日付 サンプル別の保存温度、期間についてもなるべく統一することが望ましい。 他施設で検査を行う必要のあるサンプルの場合、その輸送方法についても統一 することが望ましい。 ２　サンプルからの核酸抽出について 　この項目が、検査結果（解釈ではなく）に最も多大な影響を及ぼす部分であ るが、近い将来、本会で詳細な具体的推奨案をまとめてみたい。基本的には、 DNA抽出に際しては、同一理論を用いたキットの使用は勿論のこと、nuclease freeのチップおよびチューブの使用、RNaseを用いた残存RNAの破壊、DNA溶解 溶液の選択およびグレード、DNA濃度の測定に使用する専用キュベットの設定 および洗浄方法、nuclease freeの保存チューブの使用、保存用の分注などが 焦点となる。またgenomic DNAなのか否かによっては、抽出時により細心の注 意が必要となるので、施設間での一定の共通マニュアルの作製が望ましい。 RNA抽出に際しては、DNAの際と重複するが、RNaseの混入をさけるべく抽出者 のマスクグローブ着用は勿論のこと、RNase freeのチップおよびチューブの使 用、環境に応じてDNaseを用いた残存DNAの破壊、溶解液の選択およびグレー ド、濃度測定に使用する専用キュベットの設定および洗浄方法、RNase freeの 保存チューブの使用などである。両者とも濃度測定には各施設間で共通の数式 を使用し、A260/280の値も厳密に評価されたい（qualityが悪いサンプルは棄 却、あるいはデータベースからの抹消も考える等）。RNAについては、抽出後 ゲル電気泳動し、purityを確認することが望ましい。 　また、サンプルによっては、抽出した核酸の増幅に際し問題となる、 inhibitorおよび干渉物質を含むので、結果の解釈、特にnegative dataの報告 には注意を要する。代表的なものを以下に記す。 1. 全血中のヘモグロビン特にヘム (0.8 mmol/L以上)：DNA polymerase 2. 喀痰中の糖蛋白質：DNA polymerase 3. ヘパリン：ある種の制限酵素やpolymerase 4. EDTAやdetergents (SDSなど)： polymerase, Reverse Transcriptase [2003.05.22　小林 大介] ----------------------[English part begins here]---------------------- 'SQAMT News' is an electronic newsletter published by the Society for Quality Assurance in Molecular Diagnostic Testing for its registered members. Back issues will be posted under the heading 'About the Society -Publication' in the Society's home page shown below. (Documents with the extension ".pdf" require the latest version of Acrobat Reader, which is distributed free at http://www.adobe.com/) Contact the Society 　home page: http://sqamt.umin.jp/ 　e-mail: sqamt-adm@umin.ac.jp If you would not like to receive the succeeding issues, please send an e-mail to sqamt-adm@umin.ac.jp with the words "remove me" in the body of the message. _____________________________________________________________________ Contents ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Opinion: Items needed for the Standard Guideline in Molecular Diagnostic Methods ----------------------------[SQAMT News]----------------------------- Opinion: Items needed for the Standard Guideline in Molecular Diagnostic Methods - Handling and Management of Clinical Specimens - ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Introduction Today, we need to discuss the items essential for the guideline to lead a standard methods and management of genetic diagnosis, and this electric news have a role to describe and emphasize this aim and outline which also should be arranged with the information from US guideline. Especially the handling and management of clinical specimens is described in this issue. As it has been obvious that we face numerous numbers of items needed for the standardization, it is most important to standardize (manage) the whole steps to a final report among several institutes. In summary, the above steps are divided into the following items: 1) Management of clinical specimens and extracted samples (DNA and RNA) 2) Nucleic acid extraction 3) Quality control of reagents those essentially affects the result 4) Design for primers 5) Main protocols for the detection of target molecule 6) Selection of positive control and internal control in each method 7) Reports and interpretation of the results In addition, we need the standard manuals including the recommendations for whole these steps and important materials, and basically need the training standard for both medical technologist and the responsible persons for the test results. All the information was also obtained from the institutes and the organizations such as Massachusetts General Hospitals and related hospitals to Harvard Medical School and the committee of NCCLS (2003- 2004). Meanwhile, regarding genetic diseases, the committee of Molecular Diagnostic Methods in NCCLS consists of 17 active members; i.e., two of MD, PhD (from a city hospital and a university hospital), 1 MD from a private medical center, and the 13 PhDs (includes five members from various private enterprises、five members from various universities、 one member from NIH, and three members from NCCLS itself. In US, most of the examination for molecular diagnostic methods is actually performed by the private enterprises instead of the Division of Laboratory Medicine in the universities, and this depends on the aspects of its cost effectiveness. Indeed, the institutes related to Harvard system are also involved in this story, and almost all of those have no specific division of genetic tests. In these institutes, each clinical department does the exam by themselves in their laboratories or the samples for the genetic diagnosis should be subjected to the private enterprises. In contrast, a part of Division of Laboratory Medicine described above have their responsibility to continue the studies and efforts for genetic diagnostic methods with enough research activity and skill as well as private one. Most of these universities have some extent of difficulties in the tests which must be done for large quantity of samples using mass automated machines, and this type of tests should be done with comparable priority in big private companies. Nevertheless, a set number of university hospital completes their task and are allowed to maintain themselves because there still be studies and the way to do the genetic tests which can be performed only in the system of the university hospitals. In comparison of present status for the standardization of molecular diagnostic methods between Japan and US, the difference may not be big as most Japanese people thought. Today, NCCLS also has much difficulty in standardization of many methods for genetic diagnosis, and the basic but important three items regarding sample collection, quality assessment, and the evaluation for clinical utilities of genetic tests are still planned to be discussed in the 7 topics of this year. Incidentally, methods and its management discussed among several committees of NCCLS in 2003 are: 1) Nucleic acid sequencing for the diagnosis of cancer, genetic diseases, and infectious diseases 2) Genotyping for infectious diseases; detection of drug resistance for selection and /or monitoring of drug therapy (HIV, HBV, M. tuberculosis, and CMV), epidemiologic studies. 3) Molecular methods for Microarrays. We (also in Japan) always have the questions regarding unstable intensity of internal control expression level (which should be better or best for this) and the big contradiction with the results between different laboratories (this may due to the selection of positive controls, the difference between machines and the array plates, and the technical error). This is now hot topics in US and also a condensed subject in the standardization of various methods for genetic diagnosis for us. In this electric news, first of all, I will present private suggestions for the model case to handle and manage clinical specimens with referring to the NCCLS guideline. 1. Handling of Clinical Specimens A numerous numbers of tissue source and type of specimens are subjected to molecular diagnostic methods. For example, whole blood, isolated blood cells, whole urine (isolated cells), feces, buccal cells, cells or fluid obtained by brushing method using endoscopy, biopsy specimen, amniotic, chorionic villus sample, and sputum are involved. In the use of any types of specimens, first of all, the informed consent should be taken from the patients or their family member. Especially in molecular diagnostic methods, we may use the same sample for another test or the same test in near future. We need a standardization of filing system for the database that can be used commonly by physician, medical technologist, counselors for genetic diagnosis, and the nurse. 1) Patient name 2) Date of birth 3) Date of collection 4) Gender 5) Race/ethnicity (if applicable) 6) Sample identification number: needed for confirmation and identification of the relationship between samples and patients) The data for the number, patient name, date of birth, date of collection should be described also in the storage box) 7) Specimen type 8) Reason for requesting the test 9) Relevant clinical or laboratory information (diagnosis, symptoms, the history of the therapy and the description of the therapy, and the other information of clinical laboratory tests) 10) Pedigree (required for genetic diseases) 11) Total cost (billing information) 12) Confirmation of the informed consent (also need a signature) 13) Precise information of the test (type of test and the protocol number, kit information, the reagent information, and used control) 14) Results of the test 15) Signatures and the date (of physician and the medical technologist) The appropriate temperature for the storage should be selected by the type of samples. In the case that the test must be done in the different institutes or laboratory, appropriate method for the transportation should be standardized. 2. Nucleic acid extraction We can easily extract the nucleic acid (DNA and RNA) with standard protocol or using commercially available kit, but this is most critical step to have much effect on the test results but not on the interpretation of the results. The present committee has a plan to arrange the concrete protocol to lead an approved guideline. Basically we need to extract DNA by focusing on 1) use of commercially available extraction kit with the same technology, 2) use of nuclease free tube and tip, 3) use of RNase to remove residual DNA (occasionally), 4) selection of appropriate solution to dissolve DNA, 5) use of special cuvette for the measurement of DNA concentration and washing method, 6) use of nuclease free tube for the storage. Furthermore, it is strongly recommended that an approved guideline should be constructed for the extraction of genomic DNA, and we have to perform whole steps more carefully than in handling DNA materials for daily use. Regarding the RNA extraction (this should be the same as DNA extraction), we need 1) the use of the masks and clean gloves to avoid the contamination of RNase, 2) use of RNase free tips and tubes, 3) use of DNase to remove residual DNA, 4) selection of dissolving solution, 4) use of special cuvette for the measurement of RNA concentration and washing method, 5) use of RNase free tube for the storage. We should make sure to use common formula to obtain the concentration of DNA or RNA (not automatic indicator of the machine, as the machine sometimes gives you a wrong concentration). The A260/280value must be evaluated carefully every time we extract the nucleic acid (means that the samples with bad quality may be thrown away or remove from the database). It is strongly recommended to reconfirm the purity of RNA samples by conventional electrophoresis. Some samples contain the inhibitors or interfering substances those may affect the amplification of extracted nucleic acid, therefore we should carefully evaluate and report the results containing the negative data. The major materials are as follows: 1) Hemoglobin, especially heme in whole blood cells (0.8 mmol/L): DNA polymerase 2) Glycoproteins in sputum: DNA polymerase 3) Heparin: some restriction enzymes and polymerase 4) EDTA and certain detergents (ex: SDS): polymerase and reverse transcriptase [May 22, 2003, Daisuke Kobayashi] _____________________________________________________________________