====================================================================== ------------------- SQAMT News No.0015 [2003.12.01] ------------------ ====================================================================== [This is a bilingual mail, so please neglect queer characters if your software does not display Japanese characters. The English part appears after the Japanese part.] 　 ---------------------[Japanese part begins here]--------------------- 　「SQAMT News」は遺伝子検査精度保証研究会の発行する会員向けの電子メー ル新聞です。バックナンバーは下記ホームページの「本研究会について―出版 物」欄でご覧頂けます。 （末尾に「.pdf」がついている文書の表示には、http://www.adobe.co.jp/ で 無料配布されている Acrobat Reader の最新バージョンが必要です） 　遺伝子検査精度保証研究会および記事に関するお問い合わせ先 　　ホームページ： http://sqamt.umin.jp/ 　　電子メール　： sqamt-adm@umin.ac.jp 　なお、今後配布を希望されない場合には、誠に恐れ入りますが、その旨を書 き添えてこのまま返送して下さるようお願いいたします。 _____________________________________________________________________ Contents ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ お知らせ：会員動向 論　説　：遺伝子検査の標準化における必要決定事項（その２） 　　　　　‐核酸検出のquality controlについて- 　 ----------------------------[SQAMT News]----------------------------- お知らせ：会員動向 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ［入会］（敬称略） 2003.11.07　中川原 寛一　日本遺伝子研究所・東北大学客員教授 [2003.11.07　総務担当理事　西堀 眞弘] 　 ----------------------------[SQAMT News]----------------------------- 論　説　：遺伝子検査の標準化における必要決定事項（その２） 　　　　　‐核酸検出のquality controlについて- ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ はじめに 　本電子メールニュースでは、遺伝子検査の標準化ガイドライン作製にあた り、決定していく必要があると考えられる項目について、米国での現状も参 考にしながら、概論したい。参考とした施設および団体には、 Massachusetts General Hospital（MGH）を含めたHarvard医科大学関連病 院、NCCLSを含む。尚、上記病院およびNCCLSについての情報は、現場視察あ るいはCommitteeの関係者から得たものであることをお断りしておく。ご承 知のとおり標準化に際し必要となる決定項目は相当数あるが、どのように、 各施設間ので全行程の管理をある程度統一（標準化）するかが最も重要と思 われる。このために、推奨案、各種基準並びに注意点を網羅したマニュアル 作製と、実際に検査を行う者および責任者（プロフェッショナル）の指導育 成が必要となる。これらはすべてquality controlの一言に集約される。前 回（本年6月）は、specimenおよび核酸抽出までのステップのquality controlについて述べさせて頂いた。今回は、核酸検出のquality control で、特に重要な点について、NCCLSの来年度へ向けたガイドライン案も参考 にしながら、自身の意見を概論したい。 各種核酸検出方法における安定性の違い 1. ご承知の通り、oligo probeを用いてdirectに目的のDNAやmRNAの一部を 検出する、ハイブリダイゼーション法については、sampleからの核酸抽出お よび使用するプローブのqualityを統一すれば、結果の差異はそれほど心配 されていないのが現状である。10数年前までは、この方法でもマニュアル操 作の占める割合が大きく、実施者によって結果に大きな差異があった。しか し、現在は自動化（ロボット化）が進んでいるので、材料とキットさえ同じ であれば、同じサンプルを用いた場合の結果の再現性は、極めて高い。これ はHCVの検出キットなどの場合を考えてみるとよくわかる話である。 2. 次に、サザンブロットやノザンブロットについては、核酸抽出のquality controlが良く、用いるプローブが同じであればほぼ同様であろう、と考え るのは危険である。一番の理由はキット化や自動化が難しいというハード面 の問題である。現在、各施設（大学および企業）では、いわゆる経験のある プロフェッショナルが、施設独自のマニュアルに従って検査を行い、その施 設で独自に用いているpositive controlおよびnegative controlを横手に置 き、結果を報告している。このpositive controlのqualityが変わると、結 果の報告自体が変わる場合があるが、この点については別の機会に概論して みたい。さて、同じ施設で他の条件が全て同じでも、ある時期まで用いてい た検出試薬が別のロットに変わった場合、同じサンプルを用いてもバンドの 濃さが変わるといったことが実際に起こる。治療効果を判定する目的で検査 結果をみた医師は、当然同じ量アプライされた前回のバンドと比較して腫瘍 細胞の増減を推察することがある。我々も時々経験することであるが、前回 の結果と比べて極端にバンドが薄ければ治療内容を変更する場合もあり得 る。従って、試薬のロットだけが変わった場合でも、検査をする側は、その ことの重大性を考える感受性を持っている必要がある。余談であるが、最も ロット間差を痛切に感ずるのは、抗体を用いた蛋白の検出においてである し、こういった感受性は、日常検査業務面だけでなく、研究（実験）面で も、日々データの解釈をし続けることで養われていくと考えている。 3. さて、最も検出結果に差異が生じる検査はご承知の通り、核酸を増幅す る検査である。PCRはもとより、RT-PCRにおいては前回述べたようにサンプ ルのqualityが最も重要となる。mRNAにほんの少しでもgenomic DNAが残って いるだけで、とんでもない検査結果がでる（この場合primerがきちんと複数 のエクソンを跨いでいれば回避可能だが）。標準化ということになれば primerのquality（sequenceや脱塩など）をある程度統一することも重要で ある。試薬については、検査項目に応じてPCR bufferの組成（塩濃度）、 dNTP mixtureの使用の有無も要検討項目である。RT-PCRの場合、方法（1 stepと 2step）の選択、各サイクルの温度と時間の最適設定が各検査項目に よって微妙に異なってくることは言うまでもない。 4. また、研究面でも意外に多く話題に上るのが、核酸の試薬類への contaminationである。あり得ないバンドが見えた、あるいはTaqMan PCRや RT-PCRであり得ない増幅産物が検出された場合である。細胞の contaminationの場合は原因がかなりはっきりしているが、核酸増幅におけ る場合では、犯人を突き止めるのにかかる心労、労力は半端なものではな い。筆者もつい最近、同じラボで経験したことだが、一番きれいなはずの nuclease free waterが原因であった。Nuclease freeであるが故に、という のが逆に盲点であった。コンタミしていたDNAが壊れずに残存しており、そ の水をDNase Iで処理したところ、あり得ないはずのバンドは、ついに消え た。それは管理が徹底していないからだ、という声も多いだろうが、こうい うことこそが、標準化ガイドラインを作成する上で大切な、メンタル面での quality controlであると考えられる。人間が操作している以上、この水の 話に代表されるようなことが、いくらでもあり得る。このようなことを防ぐ には、全て目的別に試薬類を分けることが、常識的に重要な点となる。水ひ とつとっても、DNA抽出用、RNA抽出用、DNA PCR用、RT-PCR用、PCR product 用、プライマー希釈用に分けて、全てボトルを別にするくらいのことが必要 となる。このことが実際に全ての施設で徹底されれば、初めて標準化ガイド ラインのマニュアルを実施するベースができあがると考えられる。 [2003.11.20　小林 大介（VA Medical Center, Harvard Medical School）] ----------------------[English part begins here]---------------------- 'SQAMT News' is an electronic newsletter published by the Society for Quality Assurance in Molecular Diagnostic Testing for its registered members. Back issues will be posted under the heading 'About the Society -Publication' in the Society's home page shown below. (Documents with the extension ".pdf" require the latest version of Acrobat Reader, which is distributed free at http://www.adobe.com/) Contact the Society 　home page: http://sqamt.umin.jp/ 　e-mail: sqamt-adm@umin.ac.jp If you would not like to receive the succeeding issues, please send an e-mail to sqamt-adm@umin.ac.jp with the words "remove me" in the body of the message. _____________________________________________________________________ Contents ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Notice : Movement of the Membership Review : Items needed for the Standard Guideline in Molecular Diagnostic Methods - Quality control in detection of targeted nucleic acids - ----------------------------[SQAMT News]----------------------------- Notice : Movement of the Membership ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ [New Members] Kan-ichi Nakagawara, Niohon Gene Research Lab's Inc., Touhoku Univ. guest professor (Nov. 07, 2003) [Nov. 07, 2003, Secretary, Masahiro NISHIBORI] ----------------------------[SQAMT News]----------------------------- Review : Items needed for the Standard Guideline in Molecular Diagnostic Methods - Quality control in detection of targeted nucleic acids - ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ Introduction Today, we need to discuss the items essential for the guideline to lead a standard methods and management of genetic diagnosis, and this electric news have a role to describe and emphasize this aim and outline which also should be arranged with the information from US guideline. The information was also obtained from the institutes and the organizations such as Massachusetts General Hospitals and related hospitals to Harvard Medical School and the committee of NCCLS (2003- 2004). As it has been obvious that we face a numerous items needed for the standardization, it is most important to standardize (manage) the whole steps to a final report among several institutes. In addition, we need the standard manuals including the recommendations for whole these steps and important materials, and basically need the training standard for both medical technologist and the responsible persons for the test results. These processes are going to one word 'Quality control'. In previous manuscript (June, 2003), I described the quality control in handling and management of clinical specimens and extracted nucleic acids. This time I summarize important issues by focusing 'Quality control in detection of nucleic acids'. Differences in the stability of the results among several detection methods 1. As people who are engaging in genetic tests know well, the stability of the results in general hybridization methods, which detect directly targeted DNA and mRNA using specific oligo probes for DNA and mRNA sequences, is not so suspicious only in the cases nucleic acids extraction and selection of the oligo probes are kept good quality and stable. Before two decades ago, most of the steps had been manually performed, and thus the results had disagreed among several technicians or researchers. However, in the present day, most of the steps are done by automated systems, and thus the reproducibility of the results is reliably high if the starting materials and the kit (or reagents) are the same. This is easily understood when you use commercially available kit such as HCV RNA detection reagents. 2. Regarding blotting methods for DNA and mRNA, it is very dangerous to estimate that the reproducibility of the results should be compatible with general hybridization methods if the starting materials and probes are kept good quality. The majority of this reason is coming from the aspects of the difficulty in automation and in making a commercial kit. In the present day, a professional technician who has reliable experience performs these tests according to the manuals or original methods established at the institutes and reports the results using its original positive and negative control materials. The reported results may be easily altered when the positive control materials are changed to that of a different Lot No., and this issue will be left to be described in near future. Meanwhile, the density of the bands observed in the gel may be altered even if the starting samples are the same. This is sometimes caused only by the differences in the Lot No. of the reagents even if other conditions of the tests are the same as previous tests performed in the same institutes. Regarding this case, the physicians, who got the results with the purpose of determining the therapeutic effects, may estimate the decrease or increase of tumor cells in accordance with the band intensity at two different time points. As we sometimes have the same experience like this, we may change the therapeutic protocol if the band intensity was so reduced or almost negative. Thus the representative person or the person who performed the genetic tests should have the sensibility to the effect of the quality control of the reagents on the results even when only the Lot No. of using reagents is different from previous one. We may sometimes have the same experiences also in the experiments of protein detection using antibodies of different Lot No., and I think the training to acquire such sensibility is necessary not only in daily laboratory tests but also in laboratory research by keeping the activity to check and criticize the data itself. 3. Meantime, as most of the readers actually know, amplification methods for target nucleic acids is the No.1 candidate in which the results themselves are most easily affected by various biases. The conventional PCR is well known and done in almost all of the institutes, and in RT-PCR the most important point is to control the quality of specimens and extracted RNA as described in previous news (June 2003). Even if there are very small amounts of residual genomic DNA in RNA samples, the report of the results could be quite different (this is hardly occurs if the primer sets are determined as they are intron spanning primers). In the case of standardization, it is naturally important to use the same sequence to set the primer and high desalting quality in primer production. Regarding the reagents, it could be also important to determine the contents (concentration of various salts) of PCR buffers and the application of dNTP mixture (to use mixture or not) for each different target molecule. In RT-PCR methods, it is easily understood that the selection of method itself (1 step or 2 steps) should be determined for each different target mRNA and the temperature settings is most crucial point in 1 step method. 4. We accidentally have some experiences to have the PCR reagents contaminated by unknown nucleic acids. The unexpected bands in the gels or unexpected amplified products in TaqMan PCR and RT-PCR may be occurred. We can easily find contaminated bacteria in a cell culture system, but in contrast, we have to make so much effort to detect the criminal in various steps of nucleic acids amplification. I recently had such an experience that most reliable nuclease free water was contaminated. In this case it was the pit fall that we tend to belive that reagents are nuclease free and should be extremely clean. The contaminated DNA appeared without any nuclease attack, and unexpected bands were finally eliminated by DNase I treatment of that water. There should be some arguments that this case has occurred by the negligence of the management, but indeed, the situation like this make us sensitive to the importance of quality control of mental aspects in the daily work. The genetic tests are performed by human and therefore we may always have some latent mistakes like above story of water. To prevent this, one of possible way is to arrange and divide reagents according to each purposes of use. Regarding the water, we may have to prepare each exclusive bottle for DNA extraction, RNA extraction, PCR, RT-PCR, PCR product, primer dilution, etc (may have exclusive one for each target molecule). Some people say this is rather exaggerated, but if the management like this was thoroughly done in all the institutes, we can have the general basis for performing the genetic tests in accordance with proper guidelines. [Nov. 20, 2003, Daisuke Kobayashi (VA Medical Center, Harvard Medical School)] _____________________________________________________________________